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具有内毒素吸附能力的耶氏酵母和内毒素减毒大肠杆菌

发布时间:2021-01-26 阅读量:595

1、成果简介

  研发有效的内毒素LPS脱毒方法具有重要意义,本项目一方面通过KDO定量方法检测对LPS分子的吸附能力,从发酵食品中筛选到LPS吸附能力最强酵母菌株CSW。证实LPS与Y. lipolytica细胞共存一段时间后,会产生LPS含量降低的现象。通过18s r DNA分析,菌株CSW1与1.0 mg/m L来源于E. coil O111:B4的LPS共存后,可使LPS水平降低约70%,而S. cerevisiae BY4742仅使 LPS含量近30%。

  另外一方面,过敲除大肠杆菌E. coli染色体基因上与LPS合成相关基因,构建了多株能够直接合成新型特殊结构Kdo2-lipid A的突变菌株,具有低内毒素,适合用于大肠杆菌表达宿主生产各种蛋白及氨基酸。

2、关键技术

  脂多糖LPS是存在于大多数革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分,可通过激活宿主细胞内TLR4受体信号转导途径等,促进炎性细胞分泌多种细胞因子,进而引发强烈的免疫反应,造成疾病或者死亡,在食品和药品中是重要的毒力因子,因此研发有效的LPS脱毒方法具有重要意义。本成果获得了食品级的LPS脱毒菌株,具有应用前景。

  工业发酵中大肠杆菌野生型菌株中内毒素释放,是导致热原污染的重要原因,这增加了分离纯化成本,本成果从源头改造获得低毒性的大肠杆菌平台菌株,避免了发酵工程中热原产生。

3、知识产权

(1)一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法,专利号201410713700.5

(2)一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的制备与应用,专利号2015102828228

4、项目成熟度

  本成果对酵母菌株脱毒进行了系统验证,采用荧光示踪法分析了酵母菌株对 LPS 的吸附特性。通过不同LPS孵育浓度下的观察结果均表明,Y. lipolytica细胞表面呈现出明显的LPS附着现象,结合LPS定量结果,可以推测解脂耶氏酵母反应体系中LPS含量明显降低(~70%)与其细胞表面的LPS吸附特性有关;最后分析了酵母对LPS脱毒机制,因此本成果具有重要理论基础。

  通过基因工程改造获得五株E. coli突变菌株,所合成的LPS缺失了多糖长链,变为结构特殊的Kdo2-lipid A结构,通过用活菌体直接刺激HEK-Blue hTLR4细胞,发现五株突变菌株的细胞激起TLR4信号通路的活性比野生型W3110均有所下降;细胞毒性大幅降低。

5、投资期望及应用情况

LPS又称内毒素,是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质,一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中,特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。因此如何脱除LPS具有重要应用前景,将为食品和制药行业热原去除提供新的解决方法。本成果中的食品级酵母菌株,具有重要推广价值,减毒的大肠杆菌菌株也是工业发酵的良好宿主和底盘细胞。

6、拟合作方式:技术转让、合作开发、技术服务